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蛋白與蛋白相互作用分析—免疫共沉淀
  • 發(fā)布日期:2021-07-29      瀏覽次數(shù):1830
    •                                                              蛋白與蛋白相互作用分析—免疫共沉淀
                                                                            檢碩科學(xué)上海有限公司
           實驗原理

      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合抗體Fc段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的方法,是研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,主要用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)是否存在生理性相互作用。其原理是:當細胞在非變性條件下裂解時,完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用可以被保留下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,那么在細胞內(nèi)與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能被沉淀下來。目前多將精制的protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在agarose beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,beads上的protein A就能吸附抗原及其結(jié)合蛋白,通過低速離心,可以將目的抗原及其結(jié)合蛋白與其它成分分離。

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      實驗步驟

      1.轉(zhuǎn)染24-48 h后,刮取細胞,轉(zhuǎn)移到15mL離心管,1000rpm離心5min,用冰預(yù)冷的PBS洗滌細胞一次,細胞沉淀用1mL冰預(yù)冷的PBS重懸,移至Eppendorf管,4°C 12000rpm離心1min,棄上清;

      2.加入適量NP-40細胞裂解緩沖液(用前新鮮加入蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次 (每次大約30sec),4℃ 12000rpm離心1 min,上清移至新的Eppendorf管;

      3.蛋白定量,每組取適量(通常100μg-1mg)蛋白,用細胞裂解液調(diào)整體積使每組一致(通常總體積500-1000μL),加入40 μL (50% 懸浮液) Protein A/G瓊脂糖珠;

      4.4°C孵育30min – 2h,以去除蛋白與Protein A/G瓊脂糖珠的非特異結(jié)合(pre-clear);

      5.4°C,2500rpm 離心3 min,上清移至新的Eppendorf管;

      6.加入第一抗體,4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜;

      7.次日,每管加入40 μL (50% 懸浮液) Protein A/G瓊脂糖珠,4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1–3h;

      8.4°C,2500rpm 離心3 min,小心吸去上清,瓊脂糖珠用1mL裂解緩沖液洗3-4次;每次可樣品置于4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育10min;

      9.最后一次吸干所有液體,加入40μl的1×SDS 上樣緩沖液,Vortex,然后用離心機輕甩30sec;

      10.沸水煮5分鐘,12,000rpm離心1min;

      11.SDS-PAGE并進行Western blot檢測。

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      注意事項

      1.本實驗需要在4°C進行。

      2.細胞裂解采用溫和的裂解緩沖液,不能破壞細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。

      3.為防止蛋白的降解,細胞裂解緩沖液必須新鮮加入蛋白酶抑制劑,如Roche的cocktail inhibitor。

      4.要注意抗體的選擇,并不是所有抗體都適合做IP,需要仔細檢查抗體的說明書,說明書上標注適用于IP的才行。

      5.要使用對照抗體,以確保共沉淀的蛋白是由所加入的特異性抗體沉淀得到的,而不是與抗體的非特異結(jié)合。

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      個人心得

      1.通常孵育時溶液的總體積小于離心管容積的1/2,這樣有利于溶液的充分混合以保證抗原抗體的充分結(jié)合。

      2.蛋白裂解液與抗體孵育后,加入Protein A/G瓊脂糖珠前,可對Protein A/G瓊脂糖珠用蛋白裂解液洗滌一次,可將幾組需要的瓊脂糖珠一并進行洗滌,然后用蛋白裂解液重懸后再平均分到各組,這樣可以避免每管所加瓊脂糖珠在體積上的差異。

      3.檢測過表達蛋白的相互作用,用標簽抗體進行免疫沉淀比較容易,細胞裂解液需要的量較少(100-200μg);而檢測內(nèi)源性蛋白的相互作用,細胞裂解液需要的量較多(1-5mg),并且對抗體的要求更高,務(wù)必確定該抗體適用于做免疫沉淀,選擇好用的抗體,最好參考文獻。

      4.檢測過表達蛋白的相互作用,轉(zhuǎn)染24h后就可有高水平的表達,但通常我們選擇轉(zhuǎn)染后36h收細胞進行實驗。

      5.先將細胞裂解液與抗體孵育,再與Protein A/G瓊脂糖珠孵育是一種方法,也可將抗體先與Protein A/G瓊脂糖珠孵育,再與pre-clear過的蛋白裂解液孵育也是可行的。二者在結(jié)果上沒有明顯差別。

      6.洗滌可以將樣品置于4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育5-10min,也可手工顛倒混勻,然后放于冰上,重復(fù)幾次,感覺前者比較方便。

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      NP-40裂解液配方(100ml)

      NaCl:               0.8766g

      NP-40:              0.5ml

      Tris-Hcl:            Tris-Hcl:0.6057g;  Hcl:210ul

      去離子水補齊至100ml

                                                                                                                                               本篇轉(zhuǎn)至實驗之家


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